شناسایی و ارزیابی کمی قارچ fusarium graminearum و مایکوتوکسین don در ذرت با تکنیک real time pcr

چکیده قارچ fusarium graminearum با فرم جنسی ( giberella zea) عامل بیماری پوسیدگی جیبرلایی خوشه در ذرت می‏باشد که سبب کاهش کیفیت و تجمع مایکوتوکسین‏های don و zon در ذرت می‏گردد. اهداف تحقیق شامل تعیین ارتباط میان تولید داکسی نیوالنول و میزان کمی dna جدایه توکسین زای قارچ fusarium graminearum در خوشه ذرت با استفاده از تکنیک real time pcr و تفکیک این قارچ از دیگر گونه های فوزاریوم من جمله f.verticillioides,f.proliferatum,f.semitectum که دانه های ذرت موجود در ایران را در اواخر زمان برداشت کلونیزه می کنند، می باشد. بدین منظور در ابتدا تکنیک pcr با استفاده از جفت پرایمر اختصاصی قارچ f.graminearum انجام گرفت و باند اختصاصی bp300 مشاهده گردید. برای ارزیابی کمی dna با استفاده از تکنیک real time pcr، جفت پرایمری که تولید کننده باند 100bpبود استفاده گردید. برای افزایش تولید don توسط جدایه f.graminearum، جدایه روی محیط pdb کشت داده شد و پس از 15 روز در دمای 25 درجه سانتی گراد میزان don به وسیله تکنیک hplc+iac اندازه گیری شد. برای تعیین میزان تولید توکسین در بلال، آزمایش گلخانه ای صورت گرفت. بدین طریق که دانه های ذرت در گلخانه کاشته شدند. پس از ظهور بلال ها، تمامی آن ها با 2 میلی‏لیتر از ماکرو کنیدیوم‏های قارچی (سوسپانسیون قارچی) از طریق روش آلوده‏سازی کاکل مایه‏زنی شدند. 7 روز پس از مایه زنی و آلوده‏سازی ذرت‏ها، میزان don، ppm 2 تخمین زده شد. سپس برای تعیین ارتباط بین میزان تولید dna قارچی و don تولید شده، آزمایش گلخانه‏ای انجام شد. بدین ترتیب که ابتدا، دانه‏های ذرت درگلخانه کشت داده شدند. 7 روز پس از ظهور کاکل‏، تمامی بلال‏ها با 2 میلی‏لیتر از ماکرو کنیدیوم‏های قارچی از طریق روش آلوده‏سازی کاکل مایه‏زنی شدند.. این آزمایش 9 بار تکرار شد و در هر تکرار از 5 بلال استفاده گردید. یک، دو، سه، چهار، شش، هفت، نه، دوازده، پانزده و هجده روز پس از مایه‏زنی، بلال ها از ریشه جدا شده و در فریزر در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. دانه‏های هر کدام از بلال ها جدا شدند ( در این آزمایش از دانه‏های بلال استفاده گردید نه چوب بلال، زیرا در چوب میزان تجمع توکسین بیشتر است). دانه‏های جدا شده به طور تصادفی به 2 قسمت تقسیم شدند. نیمی از دانه‏ها برای استخراج dna و نیمی برای استخراج don مورد استفاده قرار گرفتند. به طور هم زمان dna قارچی نمونه‏ها با استفاده از روش استخراج dna، استخراج گردید و don موجود در نمونه با استفاده از آب استخراج گردید و هر نمونه با استفاده از ستون ایمنو افینیتی که به آنتی بادی منوکلونال تعبیه شده بود خالص گردید و غلظت don نمونه ها با استفاده از روش hplc تخمین زده شد و منحنی استاندارد با معادله 176/16 x+085/19 y= و رگرسیون 9998/0r= رسم گردید. و نمونه‏های dna استخراج شده با استفاده از دستگاه light cycle system با استفاده از تکنیکsyber green تخمین زده شدند و منحنی استاندارد با معادله 49/30 x + 353/3- y= با رگرسیون 994/0 r= توسط دستگاه رسم گردید. نتایج حاصل از real time pcr و hplc ارتباط مثبتی بین داده‏های don و dna تولید شده توسط جدایه قارچی با معادله148/3- x016/5 y= با رگرسیون 949/0 r= نشان داد.